ACCT は、2D 画像セグメンテーションのための機械学習を使用した、高速でアクセスしやすい自動細胞計数ツールです。

Scientific Reports volume 13、記事番号: 8213 (2023) この記事を引用

470 アクセス

1 オルトメトリック

メトリクスの詳細

細胞を計数することは、神経科学における疾患の進行を追跡するための基礎です。このプロセスの一般的なアプローチは、訓練を受けた研究者が画像内のセルを個別に選択してカウントすることですが、これは標準化が難しいだけでなく、非常に時間がかかります。画像内のセルを自動的にカウントするツールは存在しますが、そのようなツールの精度とアクセシビリティは改善することができます。そこで、新しいツール ACCT: トレーニング可能な Weka セグメンテーションによる自動セル計数を導入します。これにより、ユーザー主導のトレーニング後のオブジェクトセグメンテーションによる柔軟な自動セル計数が可能になります。 ACCT は、公的に入手可能なニューロンの画像と免疫蛍光染色されたミクログリア細胞の社内データセットの比較分析によって実証されます。比較のために、両方のデータセットを手動でカウントし、クラスターの計算や高度なデータ準備を必要とせずに、正確な方法で細胞を自動的に定量化するアクセス可能な手段としての ACCT の適用可能性を実証しました。

免疫蛍光画像における細胞の定量化は、研究に使用される顕微鏡データの分析に長い間、時間と必要な労力の両方が制限されるステップでした。これらの選択的画像分析技術は貴重な生理学的情報を提供することができ、訓練を受けた専門家による手動カウントが定量化の「ゴールドスタンダード」として支持されています1,2。

ここでは、自動細胞計数方法と比較するために、複数の別々の観察者による完全な手動計数を使用しました。従来、細胞定量化の一貫性を維持するための重要な側面は、理想的には実験条件を知らされずに、精度と再現性を追求する単一の観察者によってデータセットが計数されることを保証することでした。人員の増加が必ずしも速度の向上につながるとは限らないため、これにより細胞計数データの処理速度が大幅に制限されます。手動によるカウントでは、人的ミスや疲労により、データセット全体の再現性と一貫性が困難になる可能性があります。このような問題は、任意の数の画像にわたって一貫性を保つ計算モデルを利用することで回避できます。

その目的のために、ここで ACCT: GitHub (https://github.com/tkataras/Automatic-Cell-counting-with-TWS.git) でホストされている Trainable Weka Segmentation (TWS) による自動セル計数を紹介します。 TWS は、ImageJ、Python、BeanShell3、4 のスクリプトによって提供される追加の画像処理の可能性を備えた、アクセス可能な自動細胞計数手法の機械学習基盤を提供します。 TWS プログラムは、細胞ピクセルと非細胞ピクセルを区別する機械学習分類器をトレーニングおよび適用するためのグラフィカルユーザーインターフェイス (GUI) を提供します。細胞ピクセルは細胞オブジェクトにグループ化されてカウントされます。 ACCT はこのピクセルセグメンテーションを中心に構築されており、細胞レベルでの定量的な検証を提供し、最適な分類子の選択と適用を支援します (図 1)。 ACCT は、ユーザーが提供する単一チャンネル画像を処理します。複数のチャネルを持つ画像は、一度に 1 つのチャネルを表示する画像コピーを使用し、各チャネルの画像セットを個別に処理することで分析できます。

この研究では、さまざまな画像処理コンテキストでのパフォーマンスを実証するために 2 つのデータセットが使用されています。使用される最初のデータセットは、ヒト免疫不全ウイルス 1 (HIV-1)5 のエンベロープタンパク質 gp120 のトランスジェニック発現によって引き起こされる免疫および炎症活性化状態の有無にかかわらず、画像化されたマウスのミクログリアで構成されます。 NeuroHIV のこのモデル (HIVgp120tg マウス) は、ウイルスタンパク質の非存在下 (非トランスジェニック同腹子対照、活性化と呼ばれる) と比較して、HIVgp120 の存在下でのミクログリアの増加 (以下、活性化と呼ばれる) という手動カウントから観察可能な結果を提供します。休憩中）。 ACCT を使用して、図 2 に示す画像からのミクログリア細胞数の違いを評価しました。自動計数方法が実験環境で効果的であるためには、実験条件から生じるデータ表示の変動に対応できなければなりません6。ミクログリアは活性化中に形態変化を起こし、免疫蛍光染色で画像化すると形態や外観が変化することが知られています7、8。私たちは、細胞型特異的マーカーであり、ミクログリアの視覚化を可能にするイオン化カルシウム結合アダプタータンパク質-1 (Iba-1) を免疫蛍光標識した細胞画像のデータセットに焦点を当てます。ただし、この方法論と付属のスクリプトを使用すると、さまざまなイメージングコンテキストで細胞の自動定量化が可能になります。

使用した 2 番目のデータセットは、倍率 200 倍で単シナプス逆行性トレーサー染色ニューロンの公的に入手可能な画像セットです (図 3)。 Fluocell データセットと呼ばれるこのデータセットは、細胞セグメンテーションのための U-net ニューラルネットワークへの新しい追加の生成に使用されました 9,10。したがって、私たちの研究では、別の公開されたデータセットに対して ACCT の有効性をテストします。

ライフサイエンスで使用されるソフトウェアツールの存在は、本質的に機能の向上につながるわけではありません11。新しいソフトウェアツールを効果的に操作するための前提条件となる技術知識は、そのアクセシビリティに基づいて新しい方法論への障壁を生み出す可能性があります。 ACCT の目標は、完全な半教師あり画像検査の実行に対する障壁を減らすことです。 ACCT は、トレーニングデータを手作りする際にユーザーの専門知識を活用するためのツールを提供すると同時に、さまざまなアプローチからトレーニングの精度を効率的に評価する定量的なツールも提供します。 ACCT は、GUI 要素を使用してユーザーに必要なプログラミング知識を軽減することで、自動細胞計数のアクセシビリティを高めます。さらに、ACCT はカウントされた画像から統計分析を実行するため、技術的な作業負荷が軽減され、さらにツールのアクセシビリティが向上します。

画像のセグメンテーションの問題に対処する方法はたくさんあります。この複雑な問題は、画像内のすべてのピクセルに適切なラベルを割り当てることに重点が置かれています。私たちが利用している TWS プログラムは、Ilastik12 などの機械学習実装や、U-Net、ResUNet、c-ResUnet9、13、14 などのニューラルネットを含む、いくつかのソフトウェアツールの 1 つにすぎません。

デフォルトで利用できる機能の幅が広がったこと、および自動画像処理と分析を合理化する Fiji および ImageJ との統合により、Ilastik12 ではなく TWS4 を使用することを選択しました。 ImageJ との統合により、TWS は現在および将来の自動イメージングツールの構築にさらに利用しやすくなりました。

TWS や Ilastik などのプログラムは、アクセスしやすいインターフェイスを備えた優れたピクセルセグメンテーションを提供しますが、ピクセルレベルではなくセルレベルで精度とパフォーマンスを評価する必要もあります。 ACCT は、ユーザーがコマンドラインでの最小限のファイル操作でこれを実現できるフレームワークを提供します。 Ilastik のセグメンテーションでは、機械学習モデルのトレーニング後の検証段階でモデルをテストしないため、トレーニングデータセットに過剰適合するリスクが高まります。したがって、私たちの研究では Ilastik のパフォーマンスを ACCT と比較します。

さらに、ACCT のパフォーマンスを CellProfiler と比較します。CellProfiler は、ユーザーがモジュール式パイプラインを作成できるようにする画像分析に一般的に使用されるツールです15。このツールはピクセルレベルのセグメンテーションを提供しますが、関連ツール CellProfiler Analyst16 がなければ機械学習モデルを使用した自動細胞計数は提供しません。ただし、CellProfiler Analyst では、ユーザーが SQL でテキストファイルとデータベースファイルを手動で変更する必要があるため、コードエディターに関するユーザーの知識が必要です。このため、CellProfiler Analyst とは比較しません。

最後に、ResUNet は画像セグメンテーションに対する畳み込みニューラルネットアプローチ (CNN) であり、画像ラベル付けのための一般的なツールとして存在します。トレーニングデータを効果的に使用して、細胞数のばらつきが大きく、非細胞アーチファクトが存在する画像でも正確な細胞セグメンテーションを行うことが実証されました。これは U-Net の開発であり、さまざまな状況での一括細胞計数タスクに効果的であることが証明されています。さらに、c-ResUnet は ResUNet9 の拡張版です。ただし、CNN モデルは妥当な時間内に結果を生成するために高い処理能力を必要とし、高価な計算センターへのアクセスが必要になる場合があります。 ACCT は、市販の消費者向けラップトップおよびコンピュータで効率的に機能するように設計されています。

ACCT コンポーネントとプロセスの視覚的な概要。 (A) Weka と一連のトレーニング画像を使用して、反復トレーニングを通じて複数の分類子を作成します。 (B) 次に、これらの分類子が検証画像に対して一括で評価され、最適な分類子がユーザーによって選択されます。 (C) 選択した分類子は細胞定量化のための実験データセットに適用され、カウントされた画像のセットと各画像内の細胞数、および細胞形態に関する情報が生成されます。この情報には、エリア、位置、最小および最大強度、円形度、スキュー、および各セルに関する詳細が含まれており、GitHub のデータ利用可能セクションで入手できます。

Iba-1 陽性ミクログリア細胞の画像で構成されるデータセットは、私たちのグループによって最近公開された手順に従って生成されました 17。簡単に言うと、このデータセットは、修飾された GFAP プロモーターの制御下で星状細胞で可溶性 gp120 エンベロープタンパク質を発現する、HIV 誘発性脳損傷モデル (HIVgp120tg) の脳切片に由来しています。マウスは混合 C57BL/6.129/SJL 遺伝的背景にあり、生後 9 か月の雄マウスの 2 つの遺伝子型、野生型対照 (休止、n = 3) とトランスジェニック同腹子 (HIVgp120tg、活性化、n = 3) が選択されました。ランダム化は行われませんでした。 HIVgp120tg マウスは、ヒト HIV 神経病理学の特徴の中でもとりわけ、非トランスジェニック同腹子対照と比較して細胞の活性化を示すミクログリア数の増加を示します 17。動物に関するすべての実験手順およびプロトコルは、国立衛生研究所 (NIH) のガイドラインに従って実施され、サンフォードバーナムプレビーズ医学発見研究所 (SBP)、スクリップス研究所 ( TSRI）、およびカリフォルニア大学リバーサイド大学（UCR）。この研究はARRIVEガイドラインに従っています。

脳組織の採取、免疫蛍光染色、およびミクログリアの顕微鏡検査の手順は、私たちのグループによる最近の出版物に記載されています17。簡単に説明すると、マウスをイソフルランで終末麻酔し、経心臓的に \(0.9\%\) 生理食塩水で灌流しました。マウスの脳を摘出し、\(4\%\) パラホルムアルデヒド 17 中で \(4^{\circ }\hbox {C}\) で 72 時間固定しました。ビブラトーム (ライカ VT1000S、ライカバイオシステムズ、イリノイ州バッファローグローブ) を使用して脳切片を取得し、320 \(\upmu \hbox {m}\ の間隔で 40 \(\upmu \hbox {m}\) の厚さの矢状切片で大脳皮質を採取しました。 ) 各遺伝子型の脳から内側から外側に離れています。染色は、ウサギ抗イオン化カルシウム結合アダプター分子 1 (Iba-1) IgG (1:125; Wako) と二次抗体フルオレセインイソチオシアネート (FITC) を用いて実行されました。 Iba-1 染色ミクログリアの定量化のために、動物ごとに 3 つのセクションごとに 3 つの視野から大脳皮質の細胞体を計数しました。識別に十分な焦点でできるだけ多くの細胞を捕捉するために、視野ごとに 2 ～ 3 枚の画像を収集しました。顕微鏡検査は、コンピューター制御の 3D ステージと FITC フィルターを備えた Zeiss 200 M 蛍光デコンボリューション顕微鏡で実施しました。すべての画像は、Slidebook ソフトウェア (バージョン 6、Intelligent Imaging Innovations, Inc.、デンバー、コロラド州) を使用して収集されました。画像は倍率 10 倍、ピクセル解像度 1280x1280 で取得され、不規則な組織エッジを排除するために 1280x733 ピクセル領域にトリミングされました。代表的な例を図2に示します。

セグメンテーション前後の免疫蛍光標識ミクログリアの画像。野生型、非トランスジェニックマウス（「静止」）および HIVgp120tg マウス（「活性化」）の大脳皮質（層 III; 上のパネル）における Iba-1 免疫標識ミクログリアの処理済みペア画像と、付随する最終セグメンテーションの例ACCT によって生成された画像 (下のパネル)。結果として得られるオブジェクトのセグメンテーションは色分けされます (青 = 真陽性、赤 = 偽陽性、黄色 = 偽陰性)。同じ視野内の画像からセグメント化されたオブジェクトが、カウント用に最小 50 ピクセルのサイズ除外で投影されました。免疫蛍光染色と画像の取得については、以前の出版物と方法セクション 17 に記載されています。スケールバー: 100 \(\μ m\)。

手動カウントは 3 人の観察者によって実行され、カウントの精度を最も高めるために画像の明るさを調整することが許可されました。画像は、観察者が Iba-1 陽性細胞体の存在を確認できるようにするために、フィールドごとに 0.5 \(\upmu \hbox {m}\) 離れた 2 ～ 3 つの焦点面で構成される Z スタックとして収集されました。部分的にしか焦点が合っていません。ほとんどの細胞に焦点が合っていることを示す平面を、カウント用の主平面として使用しました。観察者は計数中に異なる視覚化ソフトウェアを使用しました。観察者 A は、顕微鏡と組み合わせた Slidebook ソフトウェア (コロラド州デンバーの Intelligent Imaging Innovations) を使用し、観察者 B と C は、手動カウントにフィジーディストリビューションの ImageJ 2.1.0 を使用しました。さらに、観察者 A のカウントはこのプロジェクトの開始前に実行され、迅速な総和のために細胞体のすぐ近くの画像上にカウントマーカーが配置されました。観察者 B と C は、後の細胞レベルの精度評価を可能にするために、細胞体内にカウントを配置しました。組織の損傷または厚さの不規則性により、画像領域の一部が細胞検出に適さない場合、ミクログリア数は面積に対して正規化されました（研究では合計 62 枚の画像のうち n = 3 枚）。

セグメンテーション前後の蛍光標識ニューロンの画像。セルセグメンテーションと組み合わせた Fluocell データセットから取得したトリミングされた画像 (a)。これは、c-ResUnet10 (b) と ACCT によってセグメント化された、公開されている Fluocell データセットで報告された画像 \(\hbox {MAR38S1C3R1}\_\hbox {DMR}\_20\_\hbox {o}\) からセグメント化された細胞オブジェクトを示しています。分類子ベイズ 3 (c)。結果として得られるオブジェクトのセグメンテーションは色分けされます (青 = 真陽性、赤 = 偽陽性、黄色 = 偽陰性)。 ACCT は、ノイズを除去するために 250 ピクセル未満および 5000 ピクセルを超えるオブジェクトをフィルターで除外するように設定されました。このデータセットに分水界アルゴリズムを適用しました。 ACCT はこの画像の手数の 84.6% と c-ResUnet の 86.2% を正しく識別しましたが、ACCT はすべての予測の 86.9% と c-ResUnet の 93.3% を正確に識別しました。スケールバー: 50 \(\μ m\)。

さまざまなデータに対する ACCT の有効性をさらに調査および開発するために、公開されている画像セットを使用して細胞計数研究も実行しました 9,10。 283 枚の 1600x1200 ピクセル画像は、単シナプス逆行性トレーサー (コレラ毒素 b、CTb) を介して染色されたニューロンを含むマウス脳組織の 35 \(\upmu \hbox {m}\) 枚の厚さのスライスを 200 倍の倍率で撮影したものです。このトレーサーは、毒素注射部位に接続されているニューロンのみを強調表示しました。

このデータセットには、細胞密度が高い画像と低い画像の両方、およびさまざまな量のノイズとアーティファクトが含まれています（補足図 S2）。また、多くの画像に重複または接触しているセルが含まれていることも観察されました。 Fluocell データセットは、細胞がより均一に分布し、画像あたりの細胞数がより一貫している Iba-1 陽性ミクログリアデータセットと比較すると、異なる課題を提示します。 Fluocell データの代表的な例を図 3 に示します。

このデータのフルオセル分析では、画像のサブセットは著者によって手動でカウントされ、残りの画像は自動的なしきい値処理によってカウントされました9。 ACCT をグラウンドトゥルースラベルとして人間が配置した細胞数と比較して、人間の細胞計数に対するツールのパフォーマンスを評価したいため、283 画像データセット全体 (1 人の観察者) を手動で計数しました。これにより、別の自動プロセスではなく、手動のオブザーバーセル数に対してツールを検証できるようになります。さらに、Fluocell データセットの作成者は、ResUNet9 に基づいて構築された c-ResUnet という CNN アプローチを使用して、独自の自動細胞計数プログラムを作成しました。したがって、Fluocell データセット上の ACCT と c-ResUnet および Ilastik のパフォーマンスも手動カウントで比較します。私たちは、データセットの Ilastik と CellProfiler に対してより優れた分類器を生成できる可能性があることを認めていますが、これらのプログラムにはユーザーが大規模に複数の分類器を生成して評価する機能が欠けていると主張します。したがって、これらのプログラムに対して生成する分類器の数を減らし、トレーニング中に最適な分類器を選択しました。

ACCT はオープンソースであり、GitHub (https://github.com/tkataras/Automatic-Cell-counting-with-TWS.git) で入手できます。私たちの機械学習分類器は、フィジーディストリビューション18に含まれる ImageJ 2.1.0 の TWS プラグインバージョン 3.2.34 を使用して構築されました。さらに、オープンソースの Python パッケージ: scipy、pandas、numpy、matplotlib、imageio、scikit-learn が ACCT19、20、21、22、23、24 で使用されました。

ACCT では、いくつかの異なるタイプの機械学習アプローチを選択できます。ここでの機械学習とは、画像内のセルピクセルを選択するためにユーザー指定の入力データに基づいてトレーニングされた動的モデルを指します。ユーザーは必要に応じて、Weka と互換性のある追加の機械学習アプローチをアップロードすることもできます。この論文では、Fast Random Forest4,25 と呼ばれるランダムフォレストアプローチの実装を使用します。これは TWS のデフォルトの機械学習アプローチであり、次のデフォルト機能が使用されました。

ガウスぼかし

ソーベルフィルター

ヘッセ行列

ガウスの違い

膜の突起

膜の厚さ = 1

メンブレンパッチサイズ = 19

最小シグマ = 1.0

最大シグマ = 16.0

さらに、同じく Weka4 に実装されているベイジアンネットワークモデルを使用します。 BayesNet と呼ばれるこのアプローチは、ベイズ統計モデルに従って、観察された特徴が対象オブジェクトによって条件付きで依存する、または原因となる確率を決定します26。この研究では、上記の機能に加えて、ベイジアンピクセル分類に次のパラメーターを使用します。

分散

平均

最小

最大

中央値

異方性拡散

二国間

リプシッツ

桑原

ガボール

エントロピ

隣人

細胞の検出中、大小の細胞プロセスまたはアーティファクトは、細胞に十分類似した外観を与えられた細胞体として分類できます。セルをカウントするときに最小および最大のセルオブジェクトサイズパラメーターを実装することで、このノイズに対処します。したがって、指定されたサイズ範囲外のオブジェクトは自動カウントから除外されます。この範囲は、モデルのトレーニングおよび検証中に観察される細胞体によって経験的に決定されます。

セル検出のさらなる課題は、2 つ以上のセルが隣接または重なっている場合です。これにより、複数のセルが 1 つの大きなセルとして識別されるため、ACCT は精度を高めるためにこれらのオブジェクトを分離する必要があります。したがって、ピクセルセグメンテーション後の分水界アルゴリズムをオプションで有効にします27。このアルゴリズムは輪郭によってオブジェクトを分離するために使用され、分離されたオブジェクトを独立してカウントできるようになります。 ImageJ27 で提供されるウォーターシェッドアルゴリズムのデフォルト実装を使用します。セルを密接にグループ化した Fluocell データセットで分水界セグメンテーション戦略を利用し、分水界ありとなしの ACCT のパフォーマンスを比較して、補足図 S3 のアルゴリズムの効果を実証しました。

TWS の機械学習モデルは、各画像の確率マップを生成します。確率マップは、画像内の各ピクセルを対象オブジェクトの一部である確率として表します。この確率は、ピクセルがオブジェクトの一部であるとみなされる最小確率である信頼しきい値と比較されます。ユーザーはさまざまなしきい値を設定でき、これはプログラムがオブジェクトを識別する際にどの程度保守的または寛大であるかに影響します。デフォルトでは、ACCT は 0.5 のしきい値から始まり、ユーザーはユーザーインターフェイスを通じて変更できます。従来、しきい値を厳しくすると偽陽性が減りますが、真陽性も減ります。この逆は、より多くの真陽性を識別するより緩和されたしきい値にも当てはまりますが、より多くの偽陽性も識別します。さまざまなしきい値での ACCT のパフォーマンスは、受信者オペレーター特性 (ROC) 曲線で視覚的に表されます。ただし、ACCT の TWS で使用できる一部のモデルは、信頼値として 2 進数の 0 または 1 のみを与えるため、意味のある ROC 曲線の生成が妨げられます。

Iba-1 ミクログリアデータセットのトレーニングは、計数分析には使用されなかった、ランダムに選択された 10 枚の画像から抽出されました。これらの画像は、実験遺伝子型間で均等に分布したマウスから上記の方法を使用して収集されました (図 2)。 ACCT は現在、マルチチャネル画像ではなく、単一チャネル画像のみを処理できることに注意してください。トレーニングデータに対する増分調整と、その結果として生じるピクセル分類の変化がリアルタイムで観察され、分類器が順次保存されました。

オーバートレーニングを避けるために、分類器は新しいトレーニングデータで一度に数ピクセルずつ更新され、トレーニングデータ上の更新されたピクセルセグメンテーションが TWS ですぐに観察されます。後続のトレーニングデータは、不正確なセグメンテーションの領域に対処するために選択されます。これを分類器の連続反復にわたって継続し、トレーニングデータを追加するたびに分類器のバージョンを保存します。この反復的な分類子作成スキームは、分類子がデータ上で改善しているように見えなくなるまで継続されます。次に、ACCT は実験条件を考慮して検証データとグラウンドトゥルースマーカーの精度評価を実行し、ユーザーが検証データセット全体で最高の精度と一貫性を備えた分類器の反復を選択できるようにします。

この戦略は、その後検証データセットに適用される複数の連続分類子を作成するために適用されました (図 1、補足図 S1)。最終的に、25 の逐次分類器が Iba-1 ミクログリアデータでトレーニングされました。 Iba-1 ミクログリア検証データセットは、その後のすべての分析から除外されたメインデータセットからの 10 枚の画像 (静止 n = 5、活性化 n = 5) で構成されていました。観察者 B によって細胞体の位置に固有のカウントマーカーがこれらの画像に配置され、精度、再現率、F1 スコア、精度、および静止画像と活性化画像間の精度の差のスチューデント T 検定を介してパフォーマンスが計算されました。 ACCT は、3 つ以上の実験グループを含むさらなる分析のために ANOVA 計算を実行することもできます。

Fluocell データでは、データセット内のさまざまなセグメンテーションの課題 (高度に変動する強度、高度に変動する細胞密度、重複する細胞画像、非細胞アーチファクトを含む画像) を表すためにデータセットから 10 枚のトレーニング画像が選択されました。検証データセットは、同様の課題の分布を表すために選択された 10 枚の画像の異なるセットを使用して作成されました。

各画像の真の陽性スコアは、自動カウントプロセスの各オブジェクトのピクセル位置値と照合される手動カウントマーカーの位置特定によって決定されます。各イメージの誤検知は、手動カウントを 1 つも含まない自動生成されたセルオブジェクトの総数として表されます。各画像の偽陰性は、プログラムによって自動生成されたオブジェクト内に含まれていない手動カウントマーカーの総数と、オブジェクトが不十分であることを示す単一セルオブジェクト内の 1 を超える手動カウントマーカーの数によって決定されます。分離。細胞の位置に基づいて精度を評価し、背景ピクセルを区別しないため、ACCT には真の陰性細胞の位置の決定は含まれません。この方法論は Morelli et al.9 で使用されており、精度は \(\frac{TP}{TP + FP + FN}.\) として計算されます。

私たちは、精度、再現率、F1 スコア、精度の尺度を使用して分類器のパフォーマンスを評価します。精度は、手動で配置されたマーカーに基づいて正しい自動カウントの割合であり、再現率は、手動で配置されたセルマーカーの合計のうち、自動カウントによって正常に識別された割合です。 F1 スコアは、適合率と再現率の調和平均です。精度は、偽陰性を含むすべての手動および自動カウントに対する真陽性細胞数の割合として具体的に評価されます。複数の分類子は、自動的に計算された統計分析を通じて評価できます。平均絶対誤差 (MAE) などの統計的尺度は、ACCT を通じてさらに計算され、さまざまな分類子のパフォーマンスを評価します。これらの統計を使用して、これらのメトリクスに基づいて他の自動細胞計数ツールに対する ACCT のパフォーマンスを評価しました。

この統計情報を図２〜図５に示す。図 4 は、補足表 1 にある完全なデータのサブセットです。図 9 は、さまざまな信頼しきい値での選択された精度統計を示しています。最良の F1 スコア、または適合率と再現率の異なる重み付けによる分類子の選択は、すべて分類子を選択するための有効な指標です。ただし、この研究では、最高の F1 スコアに基づいて分類器を選択しました。

検証段階での Iba-1 ミクログリアデータセットに対する個々の分類器のパフォーマンスの概要。 25 個のトレーニング済み分類器 (n = 10 画像) の F1 スコアによってランク付けされた、段階的にトレーニングされた 3 つの最も精度の高い分類器のグラフ。エラーバーは、各画像から計算されたパフォーマンス統計の平均の標準誤差を表し、統計自体はデータセット内のセルの合計から計算されます。 ACCT で使用されるパラメータ: 0.5 のしきい値、50 の最小ピクセルサイズ、および 1,000 の最大ピクセルサイズ。

次のステップとして、選択した分類器が画像の実験データセットに適用されます。この実験データセットには、トレーニングと検証に使用される画像は含まれていません。この分析では自動計数手法が繰り返され、画像ごとの他の統計情報に加えて計数された細胞の総数が報告されます。識別された各細胞の形態学的情報は、ACCT によってユーザーに報告されます。この例は補足表 2 にあります。これには、分析から生成された報告された形態学的情報の一部がリストされています。

さらに、ユーザーが選択した分類子のパフォーマンスを監査するオプションもあります。監査ではさらに手動でのカウントが必要ですが、これは検証段階で分類器のパフォーマンスを評価する方法と同じです。このステップは、すべての画像が手動でカウントされていない状況で、検証セットと比較して実験データセットで分類器がどの程度同様に実行したかを判断することを目的としています。監査は、実験データセットのサブセットを使用して実行できます。また、ユーザーがモデルの精度を評価するために手動でカウント全体を完了することを選択した場合は、データセット全体を使用して実行することもできます。これらのイメージは監査セットと呼ばれます。 Iba-1 監査セット用に、活性化ミクログリア実験画像と休止ミクログリア実験画像のそれぞれ 5 枚の画像をランダムに選択しました。 Fluocell データの監査は、Fluocell 実験データセットからの 10 枚の画像のサンプルに対して実行されました (図 5)。

Iba-1 ミクログリア画像のすべての統計テストには、トレーニングと検証に使用された画像を除くすべての画像が含まれます (静止 n = 22、活性化 n = 20)。分類子 10 が観察した実験データセットと監査セットで最大のパフォーマンスを提供したため、分類子 4 の代わりに分類子 10 の自動カウントを報告します。 gp120 陽性 (活性化) マウスの画像におけるミクログリア密度の有意な増加は、二元配置分散分析によるデータセット全体で一貫していました (\(\hbox {p} = 3.39E^{-16}\); 静止時 n = 22、活性化 n = 20) (図 6)。

データセット内の遺伝子型の分散を考慮すると、ACCT カウントと観察者の間に有意差は見つかりませんでした (観察者 A p = 0.060; 観察者 B p = 0.514; 観察者 C p= 0.440)。さらに、画像ごとのミクログリア密度は、自動カウントとすべての観察者の間で有意な相関関係を示し、安静時ミクログリア画像ではより強い相関関係が示されました（図 5）。

以下は総セル数を表します。

検証: 10 枚の画像にわたる観察者 A/B 1263/1380 セル。

実験データセット: 42 枚の画像にわたる観察者 A/B/C 5158/5035/5056 セル。

監査セット: 10 枚の画像にわたる観察者 A/B/C 1239/1207/1262 セル。

実験データセットの観察者カウントと分類器 10 からの自動カウント間のすべての相関比較の回帰直線を使用したミクログリア密度散布図の相関分析。すべての関係は、全体的に有意な正の相関関係を示しました (p および調整 \(R^{2}\) = 数値に含まれる値; \(\hbox {n}=42\))。

手動および自動カウントにおける実験遺伝子型別の平均ミクログリア密度。すべての計数方法で、相互作用効果を備えた二元配置分散分析および Tukey HSD ポストホック分析により、活性化ミクログリア画像におけるミクログリア密度の増加が見つかりました。計数方法と交互作用効果との間の差異は、統計的有意性を示さなかった。 (遺伝子型: p = \(3.39E^{-16}\); 計数方法: p = 0.096; 遺伝子型:計数方法: p = 0.224; 安静時 n = 22、活性化 n = 20)。自動カウントと観察者 B および観察者 C の間に有意差はありませんでした。ただし、ACCT カウント密度は観察者 A よりも全体的に低い傾向がありました (p = 0.0599; 安静時 n = 22、活性化 n = 20)。これは、分類器 10 が、観察者 A がカウントした静止群画像内の、かすかに染色されているか、焦点が合っていない細胞を除外した可能性があることを示唆しています。エラーバーは標準偏差を表します。

TWS 方法論によって達成される全体的な精度と再現率は、検証データセット、実験データセット、および監査データセットで同様であり、図 7 の分類子 10 に示されているように、全体的な精度と F1 は検証と比較して実験データセットで増加しました。実験データセットでは、観察者 B の手動カウントと比較して、静止画像では TWS 分類器がより保守的であり、自動カウントは活性化サンプルよりも静止画像の方が高い精度を持っていました (精度 p = 0.007477) (図 7)。 Ilastik と CellProfiler を比較すると、ACCT は Iba-1 画像の各セットにおいて両ツールよりも同様の、わずかに優れたパフォーマンスを示し、Ilastik のパフォーマンスが CellProfiler をわずかに上回っていました。さらに、フィジーでユーザーが手動で選択できる基本機能とこれらのツールを比較し、ACCT が既存のフィジーの機能にどのように基づいて構築されているかを示しました。この分析では、ローリングボールによる背景の減算、フィジーのしきい値調整ツールを使用し、背景の減算は 25 ピクセル領域、ピクセル強度のしきい値は 90 で行いました。最小および最大のオブジェクトサイズを適用しないと、この分析の精度は 0 に近くなりました。他のツールと同様に、最小ピクセルサイズは 50、最大ピクセルサイズは 1000 です。 Classifier 10 は、精度を除くほとんどの指標において、基本的な Fiji ツールよりも優れています。基本的なフィジーアプリケーションは、Iba-1 イメージのほとんどのメトリックにおいて Ilastik および CellProfiler よりも僅差で優れています。

Iba-1 陽性ミクログリアの画像に関する ACCT vs Ilastik vs CellProfiler vs Basic Fiji。 ACCT 分類子 10 と Ilastik、CellProfiler のパフォーマンス、および Fiji ツールの基本的な使用法。監査セットは、実験データセットから選択され、実験グループ間で均等に分散された検証画像セットのサイズに等しい 10 枚の画像から選択されたものです。エラーバーは、各画像から計算されたパフォーマンス統計の平均の標準誤差を表し、統計自体はデータセット内のセルの合計から計算されます。この分析で ACCT が使用したパラメータは、オブジェクトのしきい値 0.5、最小ピクセルサイズ 50、最大ピクセルサイズ 1,000 でした。

Iba-1 ミクログリアデータセットとは対照的に、Fluocell データセットは 2 つの異なる実験条件を比較しません。すべての Fluocell 統計テストには、トレーニングと検証で使用された画像を除くすべての Fluocell 画像が含まれます (n = 263)。図 8 では、ACCT 内で実装された高速ランダムフォレストおよび BayesNet モデルのパフォーマンスと、c-ResUnet、Ilastik、および基本的なフィジーの使用法を比較しました9,12。図 8 は、ClassifierRandomForest3 がほとんどの統計指標で BayesNet を上回っていることを示しています。さらに、c-ResUnet モデルは、これら 2 つの分類子と比較して、ほとんどの指標で優れたパフォーマンスを示しました。他のツールとは対照的に、Ilastik は実験および監査データセットにおいて精度よりも再現率がはるかに高く、ACCT と c-ResUnet が精度で優れています。ただし、Ilastik は実験データセットの中で最大の F1 スコアを持っています。基本的なフィジーの方法論は、他の分類器とほぼ同じように苦労しましたが、より高い精度と低い再現率で、実験データセット上の ACCT 分類器と同等の精度を提供しました。基本的なフィジーでは、50 ピクセル領域および 70 のピクセル強度しきい値でバックグラウンド減算を使用しました。このデータセットのコンテキストでは、次は総細胞数を表します。

検証: 10 枚の画像にわたる 137 個のセル。

実験データセット: 263 枚の画像にわたる 3307 個のセル。

監査セット: 10 枚の画像にわたる 247 セル。

Fluocell データセット上の ACCT vs c-ResUnet vs Ilastik vs Basic Fiji。 ClassifierRandomForest3 と ClassifierBayes3 は、それぞれ、ACCT の高速ランダムフォレストと BayesNet モデルの 3 回目のトレーニング済み反復です。 3 つのツールによる Fluocell 画像の自動カウントと Fiji ツールの基本的な使用法を、Fluocell データセットの手動カウントと比較します。エラーバーは、各画像から計算されたパフォーマンス統計の平均の標準誤差を表し、統計自体はデータセット内のセルの合計から計算されます。監査セットは、実験データセットから選択された検証画像セットのサイズに等しい 10 枚の画像から選択されたものです。使用されるパラメータは、0.5 のしきい値、250 の最小ピクセルサイズ、5000 の最大ピクセルサイズ、および分水界アルゴリズムが適用されたものです。

ACCT は、トレーニングされた分類器ごとに ROC 曲線を自動的に生成します。これにより、精度と再現率、および真陽性率と偽陽性率の間のトレードオフが視覚化されます。図 9 は、Iba-1 ミクログリアデータセットに適用された ACCT 分類器 10 の ROC 曲線を示しています。しきい値は、ピクセルがセルピクセルとして指定されるかどうかを決定するために分類器から必要な確率を表します。これらのグラフで表されるデータは、統計分析を実行する scikit-learn Python ライブラリを使用して生成されました24。

Iba-1 ミクログリア画像の検証段階後に ACCT によって生成された ROC 曲線。これは、Iba-1 染色ミクログリア画像上のさまざまな信頼しきい値での分類子 10 の偽陽性、真陽性、再現率、および適合率を示しています。オブジェクトは最小サイズ 50 ピクセル、最大サイズ 1000 ピクセルにフィルタリングされました。サンプル組織内の細胞分離が一貫しているため、分水嶺アルゴリズムは Iba-1 データセットには適用されませんでした。

図 9 は、より高いしきい値を適用すると、偽陽性率が真陽性率よりも速い速度で減少するというトレードオフを示しています。たとえば、Iba-1 データセットのピクセルセグメンテーションのしきい値を増やすと、デフォルトの 0.5 と比較して偽陽性率が減少しました。この研究では、真陽性細胞の同定の減少により全体の精度が向上しなかったため、報告された計算には 0.5 の閾値が使用されました。

ACCT は、細胞計数と画像セグメンテーションのための、よりアクセスしやすい計算ツールへの一歩です。この戦略の現在の主な利点は、各画像を手動でカウントする場合と比較して、自動カウント戦略のトレーニングと適用に必要な時間が短縮されることです。私たちの研究は、大量のデータを迅速に調査するためのこのツールの一般的な適用性を示しています。

トレーニングプロセスは、この自動細胞計数方法を成功させるために重要であり、画像化された細胞の種類に関する研究者の特有の知識に依存します。各画像セットには、細胞と培地の特性のばらつきに起因する独自の一連の課題が伴うため、正確なトレーニングデータを提供するには、対象の画像をしっかりと一貫して理解する必要があります。 ACCT は、ユーザーが画像内のこれらの特徴を調整できるように支援します。ユーザーは、画像データをより適切に表現するために、選択した機械学習モデルで分析する特定の特徴を選択できます。ユーザーごとに異なるデータがあるため、この柔軟性の追加により、ACCT がユーザー固有の画像を分析する能力が向上します。

結果は、これらの ACCT が精度に関して最も優れたパフォーマンスを発揮することを示しており、「呼び出された」セルのほとんどが実際のセルであることを示しています。再現率は精度よりも大幅に低くなる傾向があり、これらのデータセットでテストされたすべての ACCT 分類器の F1 スコアと精度の低下につながります。これは、これらのモデルが専門家の手動によるカウントよりも保守的になる傾向があることを示しています。ただし、結果は、モデルがオブジェクトを細胞として分類する場合、高い精度に基づいて正しい傾向があることを示しています。

さらに、図 6 および図 5 のミクログリア密度分析は、ACCT が専門家観察者と同様に細胞を計数することを示しています。すべての観察者のカウントにより、実験遺伝子型間でミクログリア密度の同様の平均差が確認されました。 ACCT はヒトの細胞計数結果と強い相関があり、手動計数と同様に実験条件間の違いを再現できます。したがって、複数の実験条件間の画像解析に有用なツールです。

将来的には、より正確な自動細胞計数ツールが ACCT またはその他のソフトウェアパッケージから進化する可能性が高いことを認識しています。しかし現在、ACCT は強力なパフォーマンスを示していると同時に、大規模なコンピューターネットワークやコンピューティングクラスターを必要とするすべてのアプローチよりも研究者にとってアクセスしやすいツールとなっています。場合によっては、ACCT が他の細胞計数ツールよりも優れたパフォーマンスを発揮しますが、すべてのデータセットで優れているわけではありません。ただし、一部の画像データセットでは、若干のパフォーマンスの低下と引き換えに、ImageJ 環境でのアクセシビリティと ACCT の速度を犠牲にする価値があるとユーザーが感じるかもしれません。

計算能力の点では、すべての作業は Dell Inspiron 15-7559 (2017 年 2 月発売) などの市販の消費者向けラップトップで実行されました。他の自動細胞計数ツールは、多くの場合、大規模な計算リソースを利用するように設計されています。たとえば、モレリら。は、CNN アプローチを処理するために 4 つの V100 GPU を使用しました9。 CNN ベースのツールでは、より大きな計算能力にアクセスできるクラスター、つまり複数のコンピューターのネットワークの使用を推奨しています。ただし、コンピュータクラスタはすべての研究者が利用できるわけではなく、効果的に利用するにはコマンドラインの知識も必要になる場合があります。 ACCT は、実質的なコンピュータ仕様によって制限されず、さらに、コマンドライン指向ではない研究者にとっても利用しやすいものです。

再現性のある結果は科学研究において大きな関心事であり、手動による細胞計数による再現性の確保にはコストと時間がかかる場合があります。 ACCT は分類子を単一のモデルファイルとして保存するため、簡単に共有したりダウンロードしたりできます。したがって、研究者は、モデルファイルと分析された画像のセットを共有することで、細胞計数研究の再現可能な結果と統計分析を共有できます。 ACCT によって生成された分析は Excel で編集可能なファイルとして保存されるため、ユーザーは結果を簡単に共有したり伝達したりできます。

TWS によって実装されたグラフィカルインターフェイスを中心に ACCT を構築すると、定量的分類器の検証と完全な実験コンテキストでの適用のためのインフラストラクチャが柔軟で直観的なトレーニング装置に提供されるため、使いやすさが広がります4。 ACCT は TWS などの細胞イメージング解析用の既存のツールを利用するため、プログラムに慣れている研究者は、ACCT の使用方法も簡単に習得できるはずです。

ACCT にはアクセス可能なドキュメントが含まれており、プログラムの機能と使用法を説明する取扱説明書が GitHub ページにあります。ドキュメントは、ユーザーがソフトウェアツールの使用方法を理解し学ぶために重要です。他の多くのソフトウェアツールは、コンポーネントの機能をツール自体の内部に文書化しているため、ユーザーがツールを理解して使用するにはコードをナビゲートする必要があります。これは、ACCT の Web サイトに詳細な手順が記載されており、ユーザーがコード自体に手動でアクセスする必要がなく、ツールの使用方法を説明することで回避されます。

ACCT は、より一般的に画像のセグメンテーションの問題にも適用できます。私たちの研究の焦点は神経科学の文脈における細胞計数ですが、画像が背景から分離できるオブジェクトの特徴を持っている限り、ACCT はオブジェクトを定量化できます。ただし、オブジェクトの形状がより複雑で、背景があまり特徴的でない場合は、この研究で示したものよりも複雑なモデルを選択する必要がある場合があります。この簡単な例を補足図 S4 に示します。高速ランダムフォレストモデルは、フィールドに対して建物ごとにセグメント化された画像です28。細胞ほど明確ではありませんが、ACCT が生物学的状況を超えて適用できることを示しています。全体として、ACCT は、神経科学研究やそれ以外の分野の幅広いユーザーにとって、細胞計数を含む自動解析のアクセシビリティを大幅に向上させるはずです。

現在の研究における Iba-1 データセット、その分析、および Fluocell データセット分析は、ACCT-Data-Repository (https://github.com/tkataras/ACCT-Data-Repository.git) で入手できます。分析された Fluocell データセットは、http://amsacta.unibo.it/6706/ で公開されているため、一般に入手できます。

ACCT は、GitHub (https://github.com/tkataras/Automatic-Cell-counting-with-TWS.git) からアクセスしてダウンロードできます。

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著者らは、マウスの脳組織の画像について、Nina Yuan 博士と Deepika Bhullar 博士に感謝します。この研究は、国立衛生研究所 NIH、R01 MH104131、MH105330、MH087332、DA052209 から MK への資金によって支援されました。

遺伝学、ゲノミクスおよびバイオインフォマティクスの大学院プログラム、カリフォルニア大学リバーサイド、リバーサイド、カリフォルニア、92521、米国

セオドア・J・カタラス、タイラー・J・ジャン、マーカス・カウル

カリフォルニア大学医学部生物医科学部、リバーサイド、リバーサイド、カリフォルニア、92521、米国

セオドア・J・カタラス、タイラー・J・ジャン、ジェフリー・コーリー、ヒナ・シン、ドミニク・フォク、マーカス・カウル

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このプロジェクトはTKとMKが発案しました。 TJ と TK はツールをプログラムし、画像分析研究を実行し、原稿を書きました。 JKも画像取得に参加しました。このツールのユーザーテストは、ACCT 開発中にフィードバックを提供した TK、TJ、DF によって行われました。 Iba-1 ミクログリアは HS によって画像化され、TK、HS、および DF によって手動でカウントされます。 MK氏が企画監修と原稿編集を行いました。すべての著者は、投稿前に原稿をレビューし、原稿を承認しました。

マーカス・カウルへの通信。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガーネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Kataras、TJ、Jang、TJ、Koury、J. 他 ACCT は、2D 画像セグメンテーションのための機械学習を使用した、高速でアクセスしやすい自動細胞計数ツールです。 Sci Rep 13、8213 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-34943-w

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受信日: 2022 年 6 月 9 日

受理日: 2023 年 5 月 10 日

公開日: 2023 年 5 月 22 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-34943-w

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